自体心包膜移植后受体心电活动的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.021

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (27): 4395-4400.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.27.021

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自体心包膜移植后受体心电活动的变化

解力，张晓刚，黄吕，李永林，汤小曼，张辉

重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆市 400016

出版日期:2014-06-30 发布日期:2014-06-30
通讯作者: 张晓刚，博士，教授，主任医师，硕士生导师，重庆医科大学附属第一医院心内科，重庆市400016
作者简介:解力，男，1987年生，汉族，重庆市人，重庆医科大学在读硕士，主要从心脏干细胞及心包膜组织移植方面的研究。
基金资助:
重庆市卫生局医学科学技术研究重点项目(2009-1-51)

Cardiac electrical activity after autologous pericardium transplantation

Xie Li, Zhang Xiao-gang, Huang Lv, Li Yong-lin, Tang Xiao-man, Zhang Hui

Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Online:2014-06-30 Published:2014-06-30
Contact: Zhang Xiao-gang, M.D., Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
About author:Xie Li, Studying for master’s degree, Department of Cardiology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by:
Medical Science and Technology Research Key Project of Chongqing Municipal Health Bureau, No. 2009-1-51

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体心包膜移植治疗已广泛应用于临床，主要涉及心血管修补重建、眼表疾病的治疗等领域；但其对心脏本身在缺血损伤下的保护作用却研究甚少。探索自体心包膜带瓣移植的安全性及其对缺血损伤后心肌的保护作用具有重要意义。
目的：观察心脏接受自体心包膜移植后对心电活动的影响及其对缺血心肌的保护作用。
方法：以荣昌肉猪和SD大鼠为研究对象，2种动物分别分为3组：移植组、心肌梗死组及心肌梗死+移植组，心肌梗死组及心肌梗死+移植组动物结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，移植组及心肌梗死+移植组动物以自体心包膜组织带瓣移植建立移植模型。
结果与结论： ①猪心电图监测室上性早搏常见；移植组室性早搏偶见，监测过程中未见室性心动过速和室性颤动。与心肌梗死组相比，心肌梗死+移植组室性早搏减少，超声心动图检查示心功能改善(P < 0.05)。②移植组大鼠心电图监测未见室性颤动；心肌梗死组、心肌梗死+移植组均见非致死性室性颤动。与心肌梗死组相比，心肌梗死+移植组心功能改善，心肌凋亡指数降低，Bcl-2蛋白表达升高，Caspase-3蛋白表达降低(P < 0.05)。提示自体心包膜带瓣移植未诱发恶性室性心律失常，其安全性相对较高；并在一定程度上减少缺血损伤后室性早搏个数、促进心功能恢复，其可能与抑制缺血区域细胞凋亡有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 移植, 自体心包膜移植, 带瓣移植, 心肌梗死, 室性早搏, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: The treatment of autologous pericardium transplantation has been widely applied in clinics, mainly involving cardiovascular repair and reconstruction, the treatment of ocular surface disease. The study addressing protection effects of autologous pericardium transplantation on the heart with ischemia injury is rarely reported. The investigations on the safety and protection effects of autologous pericardial transplantation on the heart with ischemia injury are of important significance.
OBJECTIVE: To explore effect of autologous pericardial transplantation on cardiac electrical activity and the protective effects on myocardial ischemia.
METHODS: Rongchang pork pigs and Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: autologous pericardium transplantation, myocardial ischemia, and myocardial ischemia + autologous pericardium transplantation. The model of myocardial ischemia was established by ligation of the left anterior descending coronary artery in the groups of myocardial ischemia and myocardial ischemia + autologous pericardium transplantation. The model of transplantation was established by autologous pericardium transplant with flap in the groups of autologous pericardium transplantation and myocardial ischemia + autologous pericardium transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Porcine electrocardiogram monitoring results showed that, superventricular premature beat was frequently observed in each group of pigs; the ventricular premature beat was occasional observed in autologous pericardium transplantation group, ventricular tachycardia and ventricular fibrillation did not appear. Compared with myocardial ischemia group, the ventricular premature beat decreased and the heart function was improved in myocardial ischemia + autologous pericardium transplantation group (P < 0.05). Rat electrocardiogram monitoring results showed that, the ventricular fibrillation did not appear in autologous pericardium transplantation group, the lethal ventricular fibrillation did not appear in myocardial ischemia and myocardial ischemia + autologous pericardium transplantation groups. Compared with myocardial ischemia group, the heart function was improved, the apoptosis index decreased, the expressions of Bcl-2 protein increased, the expressions of Caspase-3 protein decreased in myocardial ischemia + autologous pericardium transplantation group (P < 0.05). The autologous pericardium transplantation with flap cannot induce malignant ventricular arrhythmia and is relatively safe; the ventricular premature beat is reduced, the cardiac function is improved, which is possibly related to the inhibition of apoptosis in myocardial ischemic area.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: transplants, pericardium, heart valves, myocardial infarction, ventricular premature complexes

中图分类号:

R318

解力，张晓刚，黄吕，李永林，汤小曼，张辉. 自体心包膜移植后受体心电活动的变化[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(27): 4395-4400.

Xie Li, Zhang Xiao-gang, Huang Lv, Li Yong-lin, Tang Xiao-man, Zhang Hui. Cardiac electrical activity after autologous pericardium transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(27): 4395-4400.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析荣昌肉猪中心肌梗死组因麻醉过深死亡1只，心肌梗死+移植组因术中室性颤动死亡1只，因此，最终进入结果分析的移植组、心肌梗死组和心肌梗死+移植组分别为3，4，4只。

大鼠中心肌梗死组和心肌梗死+移植组在建模过程中分别死亡1，2只。因此，最终进入结果分析的移植组、心肌梗死组和心肌梗死+移植组分别为12，11，10只。

2.2 自体心包膜移植对心肌梗死模型动物心电图检测结果的影响

2.2.1 猪安静时窦性心律，心率为150-180次/min，室上性早搏可见，室性早搏偶见。猪心肌梗死后，心电图ST段明显抬高，松解去除丝线。ST段降至正常水平，出现病理性Q波、T波倒置。而进行自体心包膜治疗后心肌梗死猪仍出现室性早搏，但数量明显少于猪心肌梗死组(P < 0.05)，室速发作12次，最长7个。单纯进行自体心包膜移植的猪，出现窦性心律，心率为164-204次/min，可见室上性早搏，未见室性心动过速和室性颤动(图3，表1)。

2.2.2 大鼠大鼠正常心电图见窄qRs波，心率250- 300 次/min。大鼠心肌梗死造模过程中见ST段抬高，称大鼠心肌梗死造模成功。松解丝线后ST段可恢复正常位置。大鼠移植组、心肌梗死组、心肌梗死+移植组心电图qRs波均较大鼠正常心电图宽，且心率快，无法确定室性早搏、室性心动过速。移植组大鼠心电图监测未见室性颤动；心肌梗死组、心肌梗死+移植组均见非致死性室性颤动(图4)，由于每只大鼠每次发作持续时间无规律，故未进行定量分析。

2.3 自体心包膜移植对心肌梗死模型动物超声心动图检测结果的影响 2.3.1 猪猪移植组、心肌梗死+移植组未见室壁瘤形成，心肌梗死组有1只室壁瘤形成。与心肌梗死相比，心肌梗死+移植组左心室射血分数、左心室短轴缩短率升高、左心室侧壁的增厚率和左心室室间隔的增厚率增加(P < 0.05；表2)。

2.3.2 大鼠造模后7 d，相对于移植组，心肌梗死组大鼠左心室收缩压明显下降，左心室舒张末压增高，左心室内压最大上升速率降低(P < 0.05)；相对于心肌梗死组，心肌梗死+移植组大鼠左心室收缩压明显上升，左心室舒张末压降低，左心室内压最大上升速率上升(P < 0.05；表3)。

2.4 自体心包膜移植对心肌梗死大鼠心肌凋亡指数的影响与移植组相比，心肌梗死组和心肌梗死+移植组大鼠的心肌凋亡指数均显著增加(P < 0.05)；心肌梗死+移植组大鼠较心肌梗死组心肌凋亡指数降低(P < 0.05)；见图5。

2.5 自体心包膜移植对心肌梗死大鼠心肌组织中Bcl-2和Caspase-3表达的影响 Western blot检测结果显示，与移植组相比，心肌梗死组大鼠心肌组织中Caspase-3和Bcl-2表达水平明显增加(P < 0.05)，而与心肌梗死组相比，心肌梗死+移植组大鼠心肌组织中Caspase-3表达水平减少，但Bcl-2表达水平增加(P < 0.05)；见图6，表4。

参考文献

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年12月在重庆医科大学动物实验中心、重庆医科大学附属第一医院动物实验室及重庆医科大学生理实验室完成。

材料：

实验动物：雄性清洁级荣昌肉猪13只，3-5月龄，体质量25-28 kg，由重庆医科大学动物中心提供，动物许可证号：SYXK(渝)2012-0001。

雄性清洁级SD大鼠36只, 体质量250-300 g，由重庆医科大学动物中心提供，动物许可证号：SCXK(渝) 2012-0001。

方法：

实验动物分组：

猪：荣昌肉猪随机分为移植组(n=3)、心肌梗死组(n=5)和心肌梗死+移植组(n=5)。

大鼠：大鼠随机分为移植组(n=12)、心肌梗死组(n=12)和心肌梗死+移植组(n=12)。

心肌梗死模型的制备：

猪：禁食12 h，禁水4 h。应用阿托品(0.05 mg/kg)、氯胺酮(20 mg/kg)及安定(0.05 mg/kg)肌肉注射作诱导麻醉。开放耳缘静脉通路，静脉注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉后手术。动物取仰卧位，动物呼吸机行机械通气。从左胸前外侧切口，沿第4肋间逐层分离进入胸腔。找到左心耳，观察冠状动脉前降支走势，在第2对角支位置切开并悬吊心包，暴露心脏，于第2对角支以下2 mm处，用4-0无创伤丝线穿过冠状动脉前降支，进针深度为1.0-1.5 mm，预结扎，如有室颤发生，即刻松解丝线，进行直流电复律，必要时实行心脏按摩及注射肾上腺素、碳酸氢钠等药物抢救，预阻断后无异常时，可静推利多卡因1.5 mg/kg预防室性心律失常的发生。扎紧丝线后见到下方大面积心肌表面变得苍白，室壁运动明显减弱及心电监护ST段抬高，5 min后松解去除丝线。认为猪心肌梗死模型制备成功备用(图1)。

大鼠：用体积分数3.5%水合氯醛按10 mL/kg进行腹腔注射麻醉，将大鼠固定于小动物手术台并行气管插管，呼吸机辅助呼吸(潮气量2.0-3.0 mL/100 g，频率80次/min，呼吸比1∶1)。在距胸骨左缘5 mm处剪断第2-4肋骨，充分暴露心脏，在肺动脉圆锥和左心耳之间，定位冠状动脉左前降支，在左心耳下缘2 mm处用5-0(带线针)线穿过心肌浅层并绕过左冠状动脉前降支扎紧丝线，提起相应位置心包并剪开，心肌室壁运动明显减弱及ST段抬高。5 min后松解去除丝线，认为大鼠心肌梗死模型制备成功备用。

自体心包膜的移植：

猪：心肌梗死模型成功制备后，心肌梗死组去除完整的心包膜移植，心肌梗死+移植组带瓣游离对应缺血区域壁层心包膜5 cm²，5-0丝线固定于左心室前壁，瓣的长度以不紧张牵拉为适。逐层缝合关闭胸腔，并放置胸腔引流管。术后肌肉注射青霉素1.6×10⁶ U/d，预防感染。清醒时撤出呼吸机，适当肌注安定加束缚制动。进食不佳时静脉输注。

大鼠：心肌梗死模型成功制备后，心肌梗死组去除完整的心包膜移植，心肌梗死+移植组带瓣游离对应缺血区域壁层心包膜0.5 cm²，5-0丝线固定于左心室前壁，瓣的长度以不紧张牵拉为适。青霉素生理盐水洗创面，逐层缝合关闭胸腔。撤出呼吸机。

心电图监测：

猪：建模成功后开始心电图监测，每次监测1 h，每 12 h监测1次，共6 d。7 d后空气栓塞处死动物。

大鼠：多导电生理记录仪监测心电图，每次监测0.5 h，3次/d，共1.5 h，共6 d。7 d后心脏取血处死动物，取组织标本。

心功能检测：

猪：造模后第7天进行超声心动图检查。实验猪麻醉后仰卧位，四肢固定于实验台上，剃净胸毛，向左倾斜30°进行测定(图2)。具体测定指标为左心室射血分数、左心室短轴缩短率、左心室侧壁的增厚率和室间隔的增厚率及有无室壁瘤发生。

大鼠：造模后第7天，用多导生理仪检测大鼠左心室收缩压、舒张末压及压力最大上升速率。

大鼠心肌细胞凋亡测定：取大鼠自体心包膜移植处心肌组织切片，TUNEL法检测心肌细胞凋亡。正常心肌细胞胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞胞核呈棕黄色或褐黄色。每张切片随机选取5个400倍视野观察凋亡情况。以凋亡心肌细胞数占所有心肌细胞数的百分比作为凋亡指数评估各组心肌凋亡情况。

大鼠心肌细胞Bcl-2及caspase-3蛋白表达的测定：取大鼠自体心包膜移植处心肌组织80-100 mg，用Western blot方法。组织匀浆，RIPA提取蛋白并采用BCA方法检测蛋白浓度，每组取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到PVDF膜，体积分数5% 胎牛血清37 ℃封闭2 h；一抗1∶1 000稀释4 ℃孵育过夜；二抗1∶1 000 稀释37 ℃孵育2 h，ECL显色，感光胶片压片。内参采用GAPDH，以Bcl-2/caspase-3与GAPDH的积分吸光度比值作为其相对表达水平。

主要观察指标：心电监护测定实验猪共12 h的室性早搏个数；超声心动图测定造模7 d后猪左心室射血分数、左心室短轴缩短率、左心室侧壁的增厚率和室间隔的增厚率及有无室壁瘤发生；多导生理仪测定造模7 d后鼠左心室收缩压、舒张末压及压力最大上升速率；TUNEL法测定实验鼠缺血区域心肌凋亡情况；Western blot法测定鼠缺血区域Bcl-2，Caspase-3蛋白表达情况。

统计学分析：采用SPSS 18.0(美国SPSS公司)进行统计学分析。数据以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步比较采用SNK-q 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

心包分为纤维心包及浆膜心包，纤维心包为一纤维结缔组织，伸缩性小，较坚韧；浆膜心包又分为脏层与壁层，脏层紧贴与心肌表面，壁层与纤维心包相连，脏层与壁层之间为心包腔；浆膜层表面为间皮细胞，其具有分泌血管活性物质、激活血浆纤溶酶原、降解纤维蛋白等作用，与维持心脏功能有密切关系^[4-5]。心肌细胞作为一种终末期分化细胞，其自我更新及及修复能力十分有限，心脏整体性强，即使仅有少量细胞凋亡也可降低其整体功能。以往的观点认为坏死途径是心梗后心肌细胞的主要死亡途径，最新的研究却表明心梗相关区域内约80%的心肌细胞以凋亡形式死亡，坏死不到20%，凋亡成为心梗后细胞坏死的主要途径，在缺血损伤中占有重要地位^[6-7]。此外有研究证实心梗后左心室舒张功能与心肌细胞凋亡数量密切相关^[8]。抑制该部分细胞凋亡可明显改善左心室功能^[9]。实验结果显示正常心肌细胞有少量凋亡，心包膜组织能减少心梗区周围心肌细胞凋亡数量，从而一定程度上促进心功能恢复。实验通过对猪的研究发现，自体心包膜移植后仅出现少量室性早搏，未出现室性心动过速、室颤等恶性心律失常；通过对大鼠的研究发现，自体心包膜移植后未出现室性颤动。证实自体心包膜移植对心电活动影响相对较小，其安全性较高。既往对于动物心肌缺血的移植治疗，大多数研究选择无生物活性的异体心包膜或人工膜为载体，以直接缝合至心外膜的方式进行，但因无法做到建立体外循环、停搏心脏，手术难度较高^[10]。作者采取的自体心包膜带瓣移植方式，手术难度较小，可行性较高。

Caspase家族作为一组半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起核心作用，与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡^[11]，其激活与异常表达均可引起细胞凋亡，又称死亡蛋白酶。Caspase家族目前已发现有14个成员，大概分为2类：起始者(caspase-2，8，9，10)和执行者(caspase-3，6，7)。在凋亡过程中起始者激活执行者，引起一系列酶联反应，促进细胞凋亡。Caspase-3最初以酶原形式存在在于胞浆中，处于凋亡有序级联反应的下游，是最重要的执行者之一，是多种凋亡传导信号的汇聚点，它的活化标识着细胞凋亡进入不可逆阶段^[12]。Caspase-3作为3种细胞凋亡传导通路中的共同最终剪切酶，其主要作用为裂解抑制凋亡的蛋白、Caspase酶原、细胞外基质蛋白及骨架蛋白、DNA修复相关分子、与mRNA剪切有关的因子和DNA片段形成因子等多种底物，从而导致细胞凋亡。Bcl-2基因是第1个被发现的细胞凋亡抑制基因，相关蛋白质产物定位于线粒体内膜、内质网膜及核膜上^[13]。其相关靶点多位于线粒体，其主要生物学功能是延长细胞的寿命，增加细胞对各种凋亡刺激因素的抵抗力。其主要通过抑制BaX转位，抑制MPTP活化及开放、抑制Caspase家族的活化、减少ATP消耗及促进mtio-KATP的开放达到抗心肌凋亡的目的。在猪和大鼠心肌梗死模型基础上研究发现，自体心包膜移植后室性早搏个数减少，缺血损伤区域心肌细胞凋亡数目减少、Bcl-2蛋白表达水平增加、Caspase-3蛋白表达水平减少，心功能有所恢复。

近年来，Limana等^[14]发现小鼠心外膜c-kit阳性细胞参与了心脏修复过程，证实了心外膜和心包膜组织中富含心血管祖细胞，并具有一定的分化潜能^[15]。随后，王晓明等^[2]发现心包膜组织中的干细胞具有间充质干细胞的基本特征，可在一定条件下，分为成熟的心肌细胞。

程度上减少缺血损伤后室性早搏个数、促进心功能恢复，其可能与抑制缺血区域心肌细胞凋亡有关。本实验为临床上治疗缺血性心脏病提供了更广阔的思路。

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全文链接：

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